I.
Judul
LAPORAN MIKROBIOLOGI ISOLASI DAN IDENTIFIKASI DASAR MIKROBA
II.
Tujuan
-
Memahami cara kultifasi mikroba secara goresan, taburab maupun tatanan
-
Mengamati secara mikros maupun makros bentuk bakteri yang di isolasi dan
di tumbuhkan
-
Melakukan teknik pewarnaan secara sederhana
III.
Tinjauan Pustaka
Populasi mikroorganisme yang ada di
alam sekitar kita ini sangatlah besar dan cukup kompleks. Beratus spesies
mikroba menguasai setiap bagian tubuh kita seperti mulut, saluran pencernaan
dan kulit. Mereka terdapat dalam jumlah yang cukup besar. Sebagai contoh,
sekali kita bersin dapat menebarkan beribu- ribu mikroorganisme. Udara, tanah,
dan air yang merupakan komponen alam sebagai tempat tinggal kita juga dihuni
oleh beragam mikroorganisme. Jenis mikroorganismenya dapat berupa bakteri,
khamir, kapang dan sebagainya. Populasi dari mikroba yang ada di lingkungan ini
sangatlah beraneka ragam dan masih dalam bentuk campuran Oleh karena itu, di
dalam penelaahan terhadap suatu mikroorganisme, selain ditumbuhkan juga perlu
dilakukan isolasi. Isolasi mikroba berarti memisahkan satu jenis mikroba dari
biakan campuran menjadi satu biakan murni (populasi sel yang semuanya berasal
dari satu sel induk) Penelitian yang layak mengenai mikroorganisme dalam
berbagai habitat ini memerlukan teknik untuk memisahkan populasi campuran yang
rumit ini, atau yang biasanya dikenal dengan istilah biakan campuran, menjadi
spesies yang berbeda- beda yang dikenal dengan istilah biakan murni, dengan
kata lain terdiri dari beberapa jenis mikroorganisme atau belum murni. Biakan
murni ini terdiri dari satu populasi sel yang semuanya berasal dari satu sel
induk (Hans, 1996)
Di dalam keadaaan yang sebenarnya dapat
dikatakan bahwa tidak ada bakteri yang hidup secara tersendiri terlepas dari
spesies yang lainnya. Kerap kali bakteri patogen kedapatan bersama- sama dengan
bakteri saprob. Untuk menyendirikan atau mengasingkan suatu spesies dikenal
beberapa cara, yaitu : 1. Dengan pengenceran. Cara ini dilakukan pertama kali
oleh Lister pada tahun 1865. Ia berhasil memelihara Streptococcus lactis dalam
piraan murni yang diisolasi dari sampel susu Yang sudah masam. Suatu sampel
dari suatu suspensi yang berupa campuran bermacam- macam spesies diencerkan
dalam suatu tabung tersendiri. Dari hasil pengenceran ini kemudian di ambil
kira- kira 1 mL untuk diencerkan lebih lanjut. Jika dari pengenceran yang
ketiga ini diambil 0,1 mL untuk disebarkan pada suatu medium padat, kemungkinan
besar akan didapatkan beberapa koloni yang akan tumbuh dalam medium tersebut,
akan tetapi ada juga kemungkinan hanya akan memperoleh satu koloni saja. Dalam
hal ini dapat kita jadikan piaraan murni. Jika kita belum yakin, Bahwa koloni
tunggal yang kita peroleh tersebut merupakan koloni yang murni, maka kita dapat
mengulang pengenceran dengan menggunakan koloni ini sebagai sampel. 2. Dengan
penuangan Robert Koch (1843- 1905) mempunyai metode yang lain, yaitu dengan
mengambil sedikit sampel campuran bakteri yang mudah diencerkan, kemudian
sampel tersebut di sebar dalam suatu medium yang terbuat dari kaldu dan gelatin
encer. Dengan demikian dia memperoleh suatu piaraan adukan. Setelah medium
tersebut mengental maka selang beberapa jam kemudian nampaklah koloni- koloni
yang masing- masing dapat dianggap murni. Dengan mengulang pekerjaan di atas,
maka akhirnya akan diperoleh piaraan murni yang lebih terjamin. Dalam
mengisolasi bakteri,kapang dan khamir dapat menggunakan beberapa metode yaitu
dengan menggunakan metode gores, metode tuang, metode sebar, metode pengenceran
serta micromanipulator. Tetapi, yang paling sering digunakan adalah metode
cawan tuang dan cawan gores. Kedua metode ini didasarkan pada prinsip yang sama
yaitu mengencerkan organisme sedemikian rupa sehingga individu spesies individu
spesies dapat dipisahkan dari lainnya : 1. Metode cawan gores Metode ini
mempunyai dua keuntungan yaitu menghemat bahan dan waktu. Namun untuk
memperoleh hasil yang baik diperlukan keterampilan yang lumayan yang biasanya
diperoleh dari pengalaman. Metode cawan gores yang dilakukan dengan baik
kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya mikroorganisme yang diinginkan. Dua
macam kesalahan yang sering dilakukan adalah tidak memanfaatkan permukaan
medium dengan sebaik- baiknya untuk digores sehingga pengenceran mikroorganisme
menjadi kurang lanjut dan cenderung untuk menggunakan inokulum terlalu banyak
sehingga menyulitkan pemisahan sel- sel yang digores. 2. Metode cawan tuang
Cara lain untuk memperoleh biakan koloni murni dari populasi campuran
mikroorganisme ialah dengan mengencerkan eksperimen dalam medium agar yang
telah dicairkan dan didinginkan yang kemudian di cawankan. Karena konsentrasi
sel- sel mikroba di dalam eksperimen pada umumnya tidak diketahui sebelumnya,
maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap sehingga sekurang- kurangnyya
satu di antara cawan – cawan tersebut mengandung koloni- koloni terpisah baik
di atas permukaan maupun di dalam agar. Metode ini memboroskan waktu dan bahan
namun tidak memerlukan keterampilan yang terlalu tinggi. Proses pemisahan atau
pemurnian dari mikroorganisme lain perlu dilakukan karena semua pekerjaan
mikrobiologis, misalnya telah dan identifikasi mikroorganisme, memerlukan suatu
populasi yang hanya terdiri dari satu macam mikroorganisme saja. Teknik
tersebut dikenal dengan Isolasi Mikroba (sandjaja, 1994).
Terdapat berbagai cara mengisolasi
mikroba, yaitu: isolasi pada agar cawan, isolasi pada medium cair, dan Isolasi
sel tunggal. 1) Isolasi pada agar cawan Prinsip isolasi pada agar cawan adalah
mengencerkan mikroorganisme sehingga diperoleh individu spesies yang dapat
dipisahkan dari organisme lainnya. Setiap koloni yang terpisah yang tampak pada
cawan tersebut setelah inkubasi berasal dari satu sel tunggal. Terdapat
beberapa cara dalam metode isolasi pada agar cawan, yaitu: Metode gores
kuadran, dan metode agar cawan tuang Metode gores kuadran. Bila metode ini
dilakukan dengan baik akan menghasilkan terisolasinya mikroorganisme, dimana
setiap koloni berasal dari satu sel. Metode agar tuang Berbeda dengan metode
gores kuadran, cawan tuang menggunakan medium agar yang dicairkan dan
didinginkan (50oC), yang kemudian dicawankan. Pengenceran tetap perlu dilakukan
sehingga pada cawan yang terakhir mengandung koloni-koloni yang terpisah di
atas permukaan/di dalam cawan. 2) Isolasi pada medium cair Metode ini dapat dilakukan
apabila mikroorganisme tidak dapet tumbuh pada agar cawan. Metode ini juga
perlu dilakukan pengenceran dengan beberapa kali pengenceran. Semakin tinggi
pengenceran peluang untuk mendapatkan satu sel semakin besar. 3) Isolasi sel
tunggal Metode ini dilakukukan apabila mikroorganisme berukuran besar dan tidak
dapat diisolasi dengan metode agar cawan atau medium cair. Sel mikroorganisme
dilihat dengan menggunakan perbesaran sekitar 100 kali. Kemudian sel tersebut
dipisahkan dengan menggunakan pipet kapiler yang sangat halus ataupun
micromanipulator, yang dilakukan secara aseptis (gandjar, 2006).
IV. Alat
dan bahan
Alat
1.
Erlen Mayer
2.
Pipet Ukur
3.
Gelas Ukur
4.
Cawan Petri
5.
Tabung Reaksi
6.
Jarum Ose Ujun bulat dan runcing
7.
Ingkubator
8.
Autoclave
9.
Bunsen
10. Object Glass
Bahan
1.
Peptone dilution fluid (PDF)
2.
Nutrient agar
3.
Larutan NaCl seteril
4.
Mc Conkey agar
5.
MSA
6.
Aquades Steril
V. Gambar
alat dan Alur Proses
1.
Teknik penanaman dari suspensi
1.1.Spread plate (agar tabor ulas)
1)
Ambil suspense cairan sebanyak 0,1 ml dengan pipet ukur kemudian teteskan
di atas permukaan agar yang telah memadat
2)
Batang L atau batang drugal di ambil kemudian disemprot alcohol dan di
bakar diatas bunsen beberapa saat kemudian di dinginkan dan di tunggu beberapa
detik
3)
Kemudian disebarkan dengan menggosok kannya pada permukaan agar supaya
tetesan suspensi merata, peyebaran akan lebih efektif bila cawan ikut di campur
4)
Batang L yang terlalu panas dapat menyebbkan sel-sel mikro organism dapat
mati karena panas
1.2. Pour plate (agar tuang)
1)
Siapkan cawan steril, tabung pengenceran yang akan di tanam dan media
padat yang masih cair (>45O C)
2)
Teteskan 1 ml secara aseptis suspensi sel ke dalam cawan kosong
3)
Tuangkan media yang masih cair kecawan kemudian putar cawan untuk
menghomobenkan suspensi bakteri dan media, kemudian di ingkubasi
2.
Teknik Penanaman dengan goresan (Streak)
2.1.Goresan sinambung
1)
Sentuhkan inokulum loop pada kolono dan goresan secara kontiyu sampai
setengah permukaan agar
2)
Jangan picarkan loop, lalu putar cawan 18o C lanjutkan goresan
sampai habis
2.2.Goresan T
1)
Bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker
2)
Inokulasi daerah 1 dengan setreak zikzak
3)
Panaskan jarum inokulan dan tunggu dingin kemudian lanjutkan streak
zikzak pada daerah dua cawan duiputar untuk memper oleh goresan yagn sempurna
4)
Lakukan hal yang sama pada daerah 3
2.3.Goresan kuadran (Streak quadran)
1) NA di ambil di masukkan dalam tabung
pengenceran secara eseptis dan selanjutnya dilakukan pengenceran sampai sepuluh
10-8
2) Tiga
Pengenceran terakhir di ambil 0,1 ml untuk di tanam secara spilplat pada
medium NA setelah selesai, di ingkubasi pada 37 oC selama
1 kali 24 jam
3) Koloni akan tumbuh pada ketiga cawan
tersebut kemudian di pilih koloni yang relative terpisah dari koloni lain dan
koloni yang mudah di kenali
4) Koloni yang terpilih kemudian
ditumbuhkan atau dimurnikan NA baru dengan teknik streak kuadran. Ingkubasi 1
kali 24 jam.
3.
Teknik Pewarnaan sederhana
1)
Bersihkan objek glass dengan kapas
2)
Jika perlu tuliskan code atau nama bakteri pada sudut objek glass
3)
Bila menggunakan biakan padat maka pindahkan gores biakan dengan
menggunakan jarum enokolum satu ulasan kemudian di beri aquades dan disebarkan
supaya sel merata
4)
Keringkan ulasan tersebut sambil memfiksasi dengan api bunsen (lewatkan
diatas api)
5)
Setelah benar benar kering dan tersebar selanjutnya di tetesi dengan
pewarna menggunakan Kristal violet dan tunggu kurang lebih 30 dtk
6)
Cuci dengan aquades kemudian keringkan dengan kertas tissue
7)
Periksa dengan microskop perbesaran 10 x 40
VI. HASIL
PRAKTIKUM
1.
Pengamatan Hasil Salmonela
a.
Isolasi
Dengan bahan pemeriksaaan di tanam pada media
-
Spread plate
-
Pour plate
-
Streak kuadran
Ingkubasi 37 oC selama
18 sampai 24 jam
Hasil pengamatan
|
No
|
|
A
|
B
|
C
|
|
1.
|
Bentuk koloni
|
|
|
|
|
2.
|
Warna koloni
|
|
|
|
|
3.
|
Elefasi
|
|
|
|
|
4.
|
Konsistensi
|
|
|
|
|
5.
|
Sifat
|
|
|
|
|
6.
|
Jumlah koloni
|
|
|
|
b.
Pemeriksaan mikroskopik salmonela
Pemeriksaan mikroskopik salmonela
Bentuk : Batang
Warna : Ungu
Susunan :
Sifat :
VII.
FOTO HASIL
 |
 |
 |
||||||
 |
 |
|||||||
VIII. Pemabahasan
hasil
Isolasi mikroba
adalah memisah satu jenis mikroba denga mikroba lainya yang terdapat dialam dan
menumbuhkannya dalam satu medium buatan (sutedjo, 1996).
Prinsip isolasai
mikroba adalah memisahkan satu jenis mikrba dengan mikroba lainnya yang berasal
dari bermacam – macam campuran mikroba (sutedjo, 1996)
Metode yang
digunakan pada percobaan kali ini menggunakan metode isolasi tuang yang
merupakan metode metode isolasi dengan cara mengambil sedikit sampel campuran
bakteri yang telah di encerkan dans empel tersebut kemudian di sebarkan atau di
tuang dari medium dari kaldu dan gelatin encer (sandjaja, 1994).
Bakteri adalah kelompok besar Prokariota,
selain Archaea, yang berukuran
sangat kecil serta memiliki peran besar dalam kehidupan di bumi. Mereka sangatlah
kecil (mikroskopik) dan kebanyakan uniselular (bersel
tunggal), dengan struktur sel yang relatif sederhana tanpa nukleus/inti
sel, kerangka sel,
dan organ - organ lain seperti
mitokondria dan kloroplas. Struktur sel
bakteri memiliki sel lebih kompleks, yang disebut eukariota. Seperti
prokariota (organisme yang tidak memiliki membran inti) pada umumnya, semua
bakteri memiliki struktur sel yang relatif sederhana. Struktur bakteri yang
paling penting adalah dinding sel.
Bakteri dapat digolongkan menjadi dua kelompok yaitu Gram
positif dan Gram negatif didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel.
Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang tersusun dari lapisan peptidoglikan yang tebal
dan asam teikoat. Sementara
bakteri Gram negatif memiliki lapisan luar dari lipopolisakarida: terdiri
dari membran dan lapisan peptidoglikan yang tipis dan terletak pada periplasma
(di antara lapisan luar dan membran sitoplasma). Banyak bakteri memiliki
struktur di luar sel lainnya seperti flagela dan fimbria yang digunakan
untuk bergerak, melekat dan konjugasi.
Beberapa bakteri juga memiliki kapsula atau lapisan lendir yang membantu
pelekatan bakteri pada suatu permukaan dan struktur biofilm. Bakteri juga
memiliki kromosom,
ribosom, dan beberapa
spesies lainnya memiliki granula makanan, vakuola gas, dan magnetosom.
Media NA (Nutrien
Agar) adalah medium umum untuk uji air dan produk dairy. NA juga digunakan
untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang tidak selektif, dalam
artian mikroorganisme heterotrof. Media ini merupakan media sederhana yang
dibuat dari ekstrak beef, pepton, dan agar. Na merupakan salah satu media yang
umum digunakan dalam prosedur bakteriologi seperti uji biasa dari air, sewage,
produk pangan, untuk membawa stok kultur, untuk pertumbuhan sampel pada uji
bakteri, dan untuk mengisolasi organisme dalam kultur murni (Sandjaja, 1994).
Ada beberapa metode yang digunakan dalam percobaan isolasi dan identifikasi
dasar mikroba dan metode yang diunakan antara lain, teknik pengenceran
bertingkat tujuan dari teknik pengenceran bertingkat yaitu memeperkecil atau
mengurangi jumlah mikroba yang trsusupensi dalam cairan. Penentuan besar atau
banyaknya tingkat pengenceran tergantung pada prkiraan jumlah mikroba dan
sampel. Digunakan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan
selanjutnya sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel
mikroorganismedan pengenceran sebelumnya. Dan metode ppour plate atau agar
tuang dalam teknik ini memerlukan agar yang belum padat (> 450C)
untuk di tuang bersama susupensi bakteri kedalam ke cawan petri lalu kemudian
di homogenkan dan di biarkan memadat. Hal ini akan menyebabkan sel – sel
bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel yang ada di
dalam agar sehingga terdapat oksigen dan ada yang tumbuh didalam agar yang
tidak banyak mengandung oksigen (pleczar. 1986).
IX. Kesimpulan
Dari hasil percobaan tentang isolasi dan identifikasi dasar
mikroba dapat disimpulkan bahwa :
-
Metode –metode untuk melakukan isolasi mikroba itu ada tiga
yaitu :
1.
Isolasi pada agar cawan
2.
Isolasi pada medium cair
-
Teknik – teknik untuk melakukan isolasi mikroba antara
lain :
1.
Teknik goresan
2.
Teknik tuang / taburan
3.
Teknik sebar
4.
Teknik pengenceran
-
Fungsi isolasi mikroba adalah untuk memisahkan satu jenis
mikroba yang berasal dari biakan campuran menjadi biakan murni.
Pada pewarnaan sederhana bakteri salmonella di dapat mentuk
batang warna ungu tidak teratur.
DAFTAR
PUSTAKA
Plezar, michael. 1986. Dasar
– Dasar Mikrobiologi. Jakata :U dan D
Sandjaja B. 1994. Isolasi dan
Identifikasi Mikroba. Jakarta : widiya medika
Schagel, Hans G. 1996. Mikrobiologi
Umum. Jogja : gajah mada
Sutedjo, Mul Mulyani. 1996. Mikrobiologi
Tanah. Rineka Cipta : Jakarta
